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                                                                激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用

                                                                2019-06-12 12:32:07 38

                                                                ?

                                                                一、激光扫描共聚焦显微镜的原理
                                                                传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)采用点光源照射样本,在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点,该点被照射后发出的荧光被物镜搜集,并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔,分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能?#19978;瘢?#36825;样得到的共聚焦图像是标?#38236;?#20809;学切面,避免了非焦平面?#26174;?#25955;光线的干扰,克服了普通显微镜图像模糊的缺点,因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
                                                                ?
                                                                ?激光扫描共聚焦显微镜的原理图
                                                                原理图

                                                                ?二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点

                                                                LSCM由显微镜光学系统,激光光源,扫描装置和检测系统构成,整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进?#23567;?#26174;微镜是LSCM的主要组件,它关系到系统的?#19978;?#36136;量。通常有倒置和正置两种形式,前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
                                                                ?
                                                                三、激光扫描共聚焦显微镜的应用
                                                                一)细胞的三维重建
                                                                二)静态结构检测:原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构

                                                                20071106113106718.jpg

                                                                1.细胞原位检测核酸
                                                                用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断?#20122;?#20917;以及染色体定位观察。
                                                                2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子
                                                                原位检测蛋白质、抗体及其他分子
                                                                免疫荧光标记技术
                                                                检测荧光蛋白
                                                                3.检测细胞凋亡
                                                                检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白
                                                                4.细胞器观察及测定
                                                                探针可以直接跨过死细胞或活细胞膜,选择性地与特定细胞器结合
                                                                5.检测细胞融合
                                                                6.观察细胞骨架结构

                                                                20071106112112242.jpg?

                                                                7.观察细胞间缝隙连接通讯
                                                                8.检测细胞内脂肪
                                                                尼罗红检测动物组织中或体外培养细胞内脂滴含量
                                                                ?
                                                                三)动态观察:活体细胞或组织功能的实时动态检测
                                                                1.实时定量测定细胞内钙的变化
                                                                钙离子浓度测定和比率?#19978;?/span>
                                                                ?
                                                                2.测定细胞内PH变化
                                                                同一种探针BCECF,分别用不同激发峰激发得到的荧光比例,探究PH变化
                                                                3.检测膜电位的变化
                                                                JC-1低电位下单体存在,发绿色荧光;高电位下J-聚集体,发红色荧光,随电位增加,红色荧光也增加
                                                                4.检测细胞内活性氧物种的产生
                                                                5.药物筛选
                                                                v检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及定位
                                                                v对药物、病毒、细菌等荧光标记,检测是否进入、位置含量、动态过程
                                                                GFP和YFP,BFP和GFP等研究大分子间的相互作用
                                                                7.囊泡运输研究
                                                                利用胞吞/胞吐探针FM4-64,结合激光共聚焦、电镜、TIRF,检测囊泡的运动过程,探讨BFA对胞吞/胞吐过程的影响。
                                                                8.检测荧光漂白恢复
                                                                将待测细胞用荧光物质标记,淬灭;低强度激光扫描?#19978;洌?#38750;淬灭分子移动,直接反映荧光标记物质及其结合物的运动,因此可用来研究缝隙连接通讯的快慢.

                                                                ?20071106113334409.jpg

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                                                                综上所述,激光扫描共焦显微镜由于其高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点,在细胞水平上可作多种功能测量和分析,成为分析细胞学的一项重要研究手段。随着LSCM设备和应用技术的不断完善,它在生物医学和生命科学领域里将起到更重要的作用。


                                                                电?#30333;?#35810;
                                                                邮件咨询
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                                                                    <sub id="hzrb1"><progress id="hzrb1"></progress></sub>
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