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                                                                徠卡顯微鏡,GSDIM顯微鏡的原理

                                                                2019-06-12 18:06:02 45

                                                                ?超高分辨率顯微鏡,如受激發射損耗(STED)和類似基態耗盡單分子基礎的技術其次是個別分子報表(GSDIM / dSTORM),PALM或STORM顯微鏡依賴于相同的原則,打破了衍射極限:不需要熒光信號在圖像采集過程中關閉。?因此,GSDIM顯微鏡采用熒光團的亞穩暗態的單分子的時空分離。?為了提高進入黑暗狀態的概率,特別嵌入介質在GSDIM顯微鏡的基礎性作用。?他們的優化和替代標簽和嵌入方法的發展將讓我們有機會進一步利用這一激動人心的超分辨方法的巨大潛力。?在這里,我們測試了安裝介質的Vectashield?雙染色標本進行三維GSDIM適用性,這是此前證明了由Olivier等STORM顯微鏡

                                                                GSDIM顯微鏡的原理

                                                                的關鍵在于克服?200nm的衍射極限與GSDIM顯微鏡是打開和關閉的熒光基團,因此其時間間隔的連續閉。?在這種情況下,熒光團的電子積聚在亞,非熒光暗態(三重態和其他)應用程序由一個高功率激光束的。從暗狀態,分子返回隨機到基態,進入這是由顯微鏡檢測熒光的周期 - 即所謂的“閃爍”。?這些熒光事件被捕獲,然后隨著時間的推移。?為了獲得高分辨率的圖像,受衍射限制的事件是通過施加一個合適的算法讀出。?最后,最終的高分辨率圖像是通過繪制數千記錄事件(圖1)的測量位置的再現。

                                                                1A

                                                                ?

                                                                1B

                                                                1:(A)在GSDIM成像過程數以百計的單幀圖像,他們每個人不同的顯示閃爍的事件,被捕獲隨著時間的推移,產生一個高解析度GSDIM形象。?該GSDIM單分子本地化過程(二)簡化插圖。?為了打破衍射極限,每個閃爍事件的質心具有通過施加一個合適的算法,以位于具有納米精度。一個明顯的衍射受限情況下,以一個高斯函數;詳細地說,統計算法擬合的點擴散函數(紅色圓錐PSF)確定單個分子的質心坐標。?中的一個,并且在同一分子中的n個閃爍事件的捕獲后,計算出的坐標(插圖)作圖以重構超分辨率GSDIM圖像投影(彩色編碼圓錐)。?越質心重合,它們將出現在GSDIM圖像投影和更好他們會反映單個熒光團的實際位置的更亮。
                                                                ?

                                                                熒光團之間的相互作用和包埋劑:影響定位精度的因素

                                                                與GSDIM技術的橫向分辨率降低到20納米,可以實現。在實踐中,最終的分辨率取決于單個熒光團,它是依次由熒光團的性質和包埋介質確定的定位精度。?下面的等式[3]表明,定位的精度依賴于由一個單獨的熒光發射收集的光子數量:

                                                                ?

                                                                ΔR表示顯微鏡/物鏡的衍射極限,正由一個單獨的本地化熒光團和ΔR發出的光子的數目短信的獨特熒光團的定位精度。

                                                                最后,獲得最佳的定位精度的目的是直接關系到一個)最大化每熒光團/事件發射的光子的數目和b)最大限度地提高熒光周期的最小光漂白的數量(=)的努力。?這些特性是由熒光團的性質的相互作用,影響暗狀態,因而閃爍性能的周圍嵌入介質基本上影響。

                                                                在3D GSDIM更高的要求

                                                                在三維GSDIM系統的柱面透鏡被引入到顯微鏡的光路中。?所得到的光學散光導致那些閃爍事件不屬于在焦平面的橢圓。?這是上面的焦平面事件的點擴散函數(PSF)是豎直細長的,而那些事件所下的焦點的PSF是水平伸長。?該軟件終于把每一個閃爍的事件具有鮮明的z坐標。?顯而易見的是,這種方法需要一個良好校準的采集每個閃爍事件和高定位精度。?因此,令人印象深刻的三維數據可以與一個優化的嵌入方法(圖2)來獲得。

                                                                2A:微管廣角

                                                                微管廣角概述?
                                                                微管廣角
                                                                ?
                                                                ?

                                                                2A:微管GSD

                                                                ?

                                                                2B:線粒體廣角

                                                                線粒體廣角概述?
                                                                線粒體廣角
                                                                ?
                                                                ?

                                                                2B:線粒體GSD

                                                                ?

                                                                2:微管和線粒體的三維GSDIM高分辨率圖像?
                                                                COS-7細胞(A)和假彩色編碼的MDCK細胞(B)的線粒體指示z位置0-800納米的微管。?細胞染色對αTubulin或ATP5B,都與AlexaFluor?647,并嵌入的Vectashield?/甘油三。為了進行比較,寬視場圖像中所描繪的相應三維超分辨率圖像的上方。?比例尺為10μm。

                                                                優點和局限性 - 在GSDIM顯微鏡嵌入介質

                                                                在GSDIM顯微鏡最重要的一步是讓幾乎所有的熒光團進入長期黑暗的狀態,這是依賴于特殊的嵌入介質。?一些目前已知的介質,如葡萄糖氧化酶混合或聚乙烯醇(PVA),降低的傾向在試樣分子氧的量。?氧作為一個三線態猝滅劑,從而減少了在三線態的熒光團的量。?這是GSDIM絕對適得其反,因為三重態的一個重要途徑黑暗狀態。?因此,在三重態熒光人口減少間接導致的定位精度和最終解決一個損失,因為更多的熒光處于“開”的狀態與超分辨率圖像采集過程中的干擾。

                                                                相對于其他高解析度技術,GSDIM顯微鏡的一大優勢是其受聘于普通光學顯微鏡方法標準的熒光基團和常規染色方法的用法。熒光和包埋劑的只有結合導致的局限性。?然而,目前使用的GSDIM介質已經允許的范圍非常廣泛不同的熒光團,甚至熒光蛋白的應用。然而,他們都有各自的優點和缺點(圖3) 。?例如最常使用的介質半胱胺或β-巰基乙醇胺(MEA)是適用于大量不同的熒光基團,但不幸的介質,必須用新鮮的和它的效率下降之后顯著6小時用量,從而導致減小的閃爍性能。?因此,尋找其他嵌入介質和合適的熒光團是要充分挖掘這一超高分辨率顯微鏡方法的巨大潛力的重要一步。

                                                                ?3:在GSDIM顯微鏡不同的嵌入方法及其優缺點概述。
                                                                ?

                                                                Vectashield??-一種另類的3D GSDIM鏡包埋劑

                                                                在這種情況下奧利弗等人?能夠識別安裝介質的Vectashield?(Vectorlabs?)作為dSTORM顯微鏡足夠嵌入介質。在這里,我們測試了,如果這個新的嵌入方法可以為3D GSDIM顯微鏡采用和搜索優勢相比,目前使用的介質。?此外,我們進行了系統的屏幕在使用的Vectashield?結合工作的其他熒光團。

                                                                值得注意的是,我們發現,熒光團對AlexaFluor?647AlexaFluor?555(Life?Technologies公司?)顯示,該包埋劑優異的性能與最高的定位精度在3D GSDIM優良的閃爍性能。?這與奧利弗等人的研究結果一致。AlexaFluor?647AlexaFluor?555,我們能夠產生令人印象深刻的3D GSDIM數據(圖5)。?同的Vectashield?,AlexaFluor?647和AlexaFluor組合相比,目前使用的熒光團配對像AlexaFluor?647AlexaFluor?488在MEA或葡萄糖氧化酶混合?555甚至表現出卓越的性能閃爍。?這可以通過使用的Vectashield?或MEA分別為(圖4)進行,并強調這種包埋劑的巨大潛力事件列表兩個閃爍的圖像的對比進行可視化。

                                                                事實上,熒光一雙閃爍的性質是不是這種媒介的唯一大優勢:擁有的Vectashield處理標本?/甘油三可在4℃存放數月沒有任何損失其優良的閃爍性能(圖6)。

                                                                像它的相對強的自體熒光和由此產生的背景,尤其是在532 nm激光范圍的缺點,可以通過混合的Vectashield被削弱?與含緩沖甘油和50mM的Tris pH值8以1:10的比率。?以405nm的波長,它是用于增加熒光團的熒光的周期數所謂backpumping激光,通常不是必需的,因為其具有優異的的Vectashield?閃爍特性的任一AlexaFluor?647AlexaFluor?555。?這也可以防止背景形成。

                                                                在我們進一步的研究,以確定其他合適的熒光團,我們發現,有趣的是,熒光蛋白EYFP可接受的閃爍性能堪比中葡萄糖氧化酶混合物的性能。

                                                                不幸的是,我們沒能找到其他的熒光團,尤其是在488納米范圍內,其中AlexaFluor?488和阿托?488沒有表現出預期的閃爍性能沒有。?至于仍然未經測試的考生和越來越多的熒光基團被特別設計用于超高分辨率顯微鏡的巨大數量,熒光團的數量有限的缺點,肯定會被削弱的未來。?作為MEA的情況下,與的Vectashield?組合閃爍熒光團的名單是肯定隨時間而不斷檢測生長。

                                                                激光

                                                                染料/熒光基團

                                                                閃爍

                                                                488納米

                                                                AlexaFluor?488

                                                                -

                                                                ?

                                                                阿托?488

                                                                -

                                                                532納米

                                                                AlexaFluor?532

                                                                -

                                                                ?

                                                                AlexaFluor?546

                                                                -

                                                                ?

                                                                AlexaFluor?555

                                                                +

                                                                ?

                                                                AlexaFluor?568

                                                                -

                                                                ?

                                                                阿托?532

                                                                -

                                                                ?

                                                                羅丹明6G

                                                                -

                                                                ?

                                                                EYFP

                                                                +

                                                                647 nm處

                                                                AlexaFluor?647

                                                                +

                                                                ?

                                                                標簽1:驗證熒光團(也比較奧利維爾等人,列出的熒光團是在COS-7細胞中嵌入的Vectashield?/甘油-三(1:10)通過ATP5B和αTubulin的免疫染色測試。?與Leica SR GSD 3D系統的閃爍行為進行了評價。

                                                                答:MEA?
                                                                B:Vectashield?/甘油三

                                                                ?4:MEA和的Vectashield?/甘油-三包埋標本的單幀圖像比較。?AlexaFluor的事件列表中的單幀圖像?488染色ATB5B標本在100毫米MEA在PBS pH值7.4(A)和AlexaFluor?555染色ATB5B標本在1:10的Vectashield?/甘油三(B)。?相對于(A),AlexaFluor?中的Vectashield?555?/甘油三(B)具有大量的明亮,層次分明,互不重疊的閃爍事件。?這是一個先決條件,較高的定位精度。

                                                                ?

                                                                5A:GSD(右)/廣角(左)對比

                                                                ?

                                                                5B:GSD(左)/廣角(右)的比較

                                                                ?

                                                                5:3D GSDIM高分辨率圖像 - 線粒體和微管的雙重染色。?COS-7細胞進行染色對αTubulin和ATP5B與AlexaFluor?647AlexaFluor?555分別。?標本嵌入的Vectashield?/甘油三。?GSDIM的比較和卷積廣角3D堆棧。?微管(αTubulin)以紅色顯示為綠色和線粒體(ATP5B)。

                                                                6A

                                                                微管?
                                                                線粒體
                                                                ?
                                                                ?
                                                                ?

                                                                6B

                                                                微管?
                                                                線粒體
                                                                ?
                                                                ?
                                                                ?

                                                                6:三維高分辨率圖像比較:新鮮(A)與兩個月大(B)標本。?在綠色微管和分別為紅色或假彩色編碼線粒體(A)3D GSDIM圖像,說明z位置。?如在圖5中,試樣中嵌入的Vectashield /甘油-TRIS。?(B)在圖5和圖6A中所用的試樣,在4℃保存2個月,然后再次成像,仍然嵌入的Vectashield?/甘油-TRIS。

                                                                染色方法

                                                                COS-7細胞培養一天,在精度蓋玻片(Marienfeld的-高級?),然后固定用冰冷的甲醇中。?用PBS含1%奶粉的1小時的塊后,將細胞溫育在1:100在PBS中的比率是針對ATP5B(圣克魯斯?)和α-微管蛋白(Sigma公司?)初級抗體2小時/奶粉。?標注與AlexaFluor?647AlexaFluor?555分別與第一抗體,第二抗體在PBS中稀釋度為1:200孵育1小時。?除非奶粉塊中的每個步驟是伴隨著由四個洗滌步驟用PBS。

                                                                嵌入過程

                                                                如描繪在圖7中,細胞包埋在的Vectashield?/甘油-TRIS-緩沖液(的Vectashield?和甘油-Tris-緩沖液中以1:10的比例;甘油以50mM的Tris pH值8),如下所示:75-100μL培養基被放置在凹部滑動的空腔。?然后將蓋玻片放置在低氣壓滑動朝向介質和抑郁癥的細胞。?在此步驟中,以避免任何氣泡是很重要的。?過量的介質必須由濾紙去除,以確保雙組分硅氧烷Twinsil?是能夠正確地干燥。?Twinsil的黃色和藍色分量?為1:1混合,然后施加到蓋玻片的邊緣。?10分鐘后,聚硅氧烷硬化和試樣準備好GSDIM成像。

                                                                ?7:嵌入程序
                                                                ?

                                                                ?

                                                                展望

                                                                由單個熒光事件的區域或時間間隔打破了衍射障礙已經徹底改變了光鏡。?在未來,不會有由于衍射極限更高的分辨率的限制,但顯微鏡與不斷減少的限制分辨率的發展揭示了新的挑戰,比如GSDIM顯微鏡的情況下,標簽或嵌入介質。?正如前面提到的,在所有的超分辨率方法的關鍵步驟是獲得熒光在黑暗的一面,這是基礎,良好的定位精度。?在GSDIM顯微鏡,這個過程主要是由包埋劑的存在所影響。?這里,嵌入介質和熒光團的性質之間的相互作用是成功的高分辨率成像的決定性因素。

                                                                如今,我們擁有強大的熒光團配對像AlexaFluor?647AlexaFluor?488在MEA或AlexaFluor?647和AlexaFluor中的Vectashield?555?/甘油-三,允許收購令人印象深刻的3D超分辨率圖像的兩種顏色。?在不久的將來我們與包埋劑的Vectashield?結合高效的熒光基團的劇目是一定要通過不斷試驗和實踐經驗進行擴展。?再加上像STED顯微鏡等高分辨率技術,這會給我們細胞生命和它的生化調控的一個全新的觀點。



                                                                電話咨詢
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